Identificazione e caratterizzazione del ruolo fondamentale di alcune proteine che riparano rotture della doppia elica del DNA

[03/02/2010]

Abstract:

Le cellule di tutti gli organismi subiscono frequentemente alterazioni del proprio genoma. Infatti, numerosi agenti chimico-fisici presenti nell’ambiente ed alcuni prodotti del normale metabolismo cellulare sono capaci di modificare la struttura del DNA. Se tali eventi non fossero riconosciuti dalla cellula, e le lesioni non venissero riparate, l’organismo accumulerebbe un enorme numero di mutazioni, che portano ad instabilità genomica ed all’insorgenza di tumori.

Fortunatamente, esistono dei meccanismi di sorveglianza e di riparazione del DNA che ne controllano la qualità e, se individuano alterazioni pericolose, attivano una risposta da parte della cellula volta a limitare i danni e a riparare le lesioni. Un tipo particolarmente tossico di danno al DNA è la rottura della stessa doppia elica del DNA.

Infatti, se non riparato correttamente, porta alla perdita di interi cromosomi ed a loro ri-arrangiamenti.

Uno studio svolto dal nostro gruppo di ricercatori dell’Università degli Studi di Milano, coordinato da Federica Marini e Paolo Plevani, in collaborazione con il laboratorio del Cancer Research UK, coordinato da Simon J. Boulton, ha identificato il ruolo fondamentale di alcune proteine, HELQ-1 e RFS-1, che riparano tagli della doppia elica del DNA (Ward, 2010).

PERCHE’ E’ IMPORTANTE L’ARTICOLO

E’ di fondamentale importanza identificare e comprendere il ruolo delle proteine coinvolte nei meccanismi di riparazione del DNA, in quanto esse sono gli attori principali che mantengono la stabilità del genoma e prevengono l’insorgenza di tumori.

STATO DELL’ARTE E STUDI PRECEDENTI

Il DNA (e quindi il genoma di tutti gli organismi) è il bersaglio sia di una serie di agenti chimico-fisici presenti nell’ambiente che di prodotti del normale metabolismo cellulare che inducono sul DNA una varietà di lesioni.

Questi danni al DNA devono essere rimossi attraverso una serie di meccanismi di riparazione specifici che dipendono sostanzialmente dal tipo di lesione prodotta sul DNA (Hakem, 2008). Rotture della doppia elica del DNA sono estremamente citotossiche e possono portare alla perdita di interi pezzi di cromosomi ed a riarrangiamenti genomici. Per questo motivo in tutte le cellule esistono diversi meccanismi di riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA.

Uno di questi è la ricombinazione omologa che recupera le informazioni di sequenza dal cromosoma fratello (Wyman and Kanaar, 2006). Tagli a doppia elica del DNA possono avvenire nella cellula anche in maniera programmata nelle cellule germinali, durante il processo di formazione dei gameti detto meiosi. Grazie a tale processo, da una cellula diploide si ottengono due gameti aploidi che si fonderanno per dare un nuovo organismo.

In questo caso la rottura a doppia elica del DNA, riparata tramite ricombinazione omologa copiando informazione genetica dal cromosoma omologo, è un’importante fonte di variabilità genetica, essenziale per la sopravvivenza delle specie. E’ facile comprendere come in questo caso una mancata riparazione delle rotture a doppia elica del DNA porta all’incapacità di produrre gameti fertili e quindi alla sterilità dell’individuo (Watson, 2008).

CORPO DEL TESTO

Data l’importanza del comprendere come vengano riparati i tagli alla doppia elica del DNA, molti laboratori in tutto il mondo hanno identificato diversi fattori che hanno un ruolo fondamentale nella ricombinazione omologa. In particolare attore principale è RAD51, proteina che ha la capacità di formare un filamento elicoidale attorno al DNA a singola elica. Infatti, in seguito alla formazione della rottura della doppia elica del DNA, degli enzimi, detti esonucleasi, processano le estremità del DNA e sono in grado di digerire uno dei due filamenti del DNA. RAD51 si lega a tale estremità a singola elica del DNA ed è straordinariamente capace di riconoscere una sequenza di DNA a doppia elica omologa che viene utilizzata come stampo per riparare correttamente la rottura del DNA. Finora non era chiaro come avvenissero le fasi finali della riparazione del DNA e come RAD51 fosse in grado di abbandonare il DNA per permettere il finale ricongiungimento delle due estremità del DNA. Il nostro gruppo è riuscito proprio ad identificare due proteine, HELQ-1 e RSF-1 che hanno il ruolo di spostare RAD51 dal DNA nelle fasi finali della ricombinazione omologa. Abbiamo utilizzato come oggetto delle nostre ricerche il verme nematode Caenorhabditis elegans che vive nel suolo e che si sta rivelando un ottimo organismo modello per studiare processi essenziali per il mantenimento dell’integrità cromosomica, che sono altamente conservati dal verme all’uomo. Infatti C.elegans è anatomicamente molto semplice, lungo 1 mm, trasparente, facile ed economico da coltivare in laboratorio. Il suo ciclo vitale è di soli tre giorni, rendendo veloci le analisi genetiche. Le sue gonadi sono visualizzabili al microscopio ove è facile seguire i diversi momenti del processo meiotico di formazione dei gameti (Brenner, 1974). E’ possibile anche seguire la formazione e successiva riparazione per ricombinazione omologa dei tagli a doppia elica del DNA, che, come sopra detto, avvengono in maniera programmata durante la meiosi. Infatti, siamo riusciti a dimostrare che l’assenza di HELQ-1 e di RFS-1 porta proprio ad un accumulo di RAD51 sul DNA e ad una mancata formazione dei gameti. Successivi studi biochimici ci hanno permesso di confermare il ruolo essenziale di queste due proteine, conservate anche nell’uomo, nella riparazione del DNA.

Figura - 1 - Visualizzazione della mancata riparazione delle rotture a doppia elica del DNA nelle gonadi di C.elegans.
A.Rappresentazione schematica del verme C.elegans. B.Gonade del verme vista al microscopio a fluorescenza. I nuclei sono rappresentati in blu, mentre i foci di accumulo di RAD51 sono in rosso. In un verme selvatico RAD51 si accumula solo in un momento della meiosi (fine zigotene, inizio pachitene) e poi sparisce, indicando una corretta riparazione dei tagli a doppia elica del DNA (immagine a sinistra). Mutazioni nei geni HELQ-1 ed RFS-1 portano ad un accumulo di RAD51 ed ad una mancata riparazione del danno (immagine a destra).

CONCLUSIONI

La mancata riparazione dei tagli a doppia elica del DNA causa un aumento nel numero di mutazioni e provoca alterazioni vistose nei cromosomi. L’insieme di questi fenomeni provoca un aumento dell’instabilità del genoma che è correlabile sia ad un aumento della predisposizione all’ insorgenza di tumori, che a specifiche malattie genetiche, ai fenomeni d’ invecchiamento ed alla sterilità. Il concetto che l’instabilità genomica è alla base della cancerogenesi è diventato uno dei paradigmi centrali della biologia moderna e riceve continue conferme sperimentali. Quindi l’identificazione di nuove proteine coinvolte nella riparazione del DNA rappresenta un ulteriore passo verso la comprensione di quei meccanismi fondamentali per un corretto funzionamento dell’organismo.

Figura - 2 - Rappresentazione schematica degli eventi iniziali di riparazione di un a rottura a doppia elica del DNA. A. Taglio della doppia elica del DNA. B. Proteine, dette esonucleasi, digeriscono un elica del DNA, lasciando un’estremita 3’ a singola elica. C. Molte molecole di RAD51 si legano al DNA a singola elica, formando una struttura elicoidale. D. Il filamento di RAD51 riconosce DNA a doppia elica con sequenza omologa e lo invade. L’azione combinata di HELQ-1 e RFS-1 rimuove RAD51 per terminare la riparazione del DNA.

BIBLIOGRAFIA

Brenner, S. (1974). The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics 77, 71-94.
Hakem, R. (2008). DNA-damage repair; the good, the bad, and the ugly. Embo J 27, 589-605.
Wyman, C., and Kanaar, R. (2006). DNA double-strand break repair: all's well that ends well. Annu Rev Genet 40, 363-383.
Ward J.D., Muzzini D.M., Petalcorin M.IR, Perez E.M., Martin J.S., Plevani P., Cassata G., Marini F., Boulton S.J. (2010) Overlapping mechanisms promote post-synaptic RAD-51 filament disassembly during meiotic double-strand break repair. Molecular Cell 37, 151-294.
Watson, J.D., Baker, T.A., Bell, S.P., Gann, A., Levine, M., Losick, R. (2009) Biologia molecolare del gene 6e. Ed Zanichelli.

SITOGRAFIA

Molecular Cell
http://www.cell.com/molecular-cell/home

SBB - Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie, UniMI
http://www.sbb.unimi.it/

Dr. Federica Marini
http://www.sbb.unimi.it/espressione_genica.htm

Dr. Simon Boulton
http://science.cancerresearchuk.org/research/loc/london/lifch/boultons/