Formazione e funzione dei circuiti nervosi nel sistema nervoso centrale: il ruolo del recettore olfattivo

[30/10/2009]

Text:

I NSO, dissociati dall’epitelio nasale di ratti e posti in coltura, sono stati trasfettati con un sensore per il cAMP (Fig. 8).

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Il sensore di cAMP (Fig. 9) permette di valutare le variazioni di cAMP con alta risoluzione spaziale e temporale, in risposta a stimoli in grado di aumentare le concentrazioni di cAMP.

Con questa tecnica abbiamo osservato che nei NSO trattati con agenti farmacologici e fisiologici (odori) era presente un incremento di cAMP in tutto il NSO, incluso l’assone terminale.

Valutando i tempi con cui si realizzava questo incremento, abbiamo trovato che l’incremento si verificava pressoché contemporaneamente alle cilia-dendrite e all’assone terminale e più lentamente al soma.

Questi dati indicano che:

1. la presenza di cAMP a livello dell’assone terminale è il risultato di sintesi locale e non di un processo di diffusione a seguito della attivazione del RO espresso sulle cilia;
2. il RO all’assone è funzionante e in grado di legare gli odori.

Per valutare direttamente la funzione del RO all’assone, il RO qui espresso è stato stimolato con odori applicati localmente con una pipetta di vetro.

Figure da 1 a 9:

In queste condizioni è stato possibile rilevare un incremento di cAMP esclusivamente all’assone. Questi dati indicano chiaramente che il RO all’assone terminale è funzionante, in grado di legare gli odori e dare luogo a sintesi locale di cAMP.

E’ noto che alle cilia-dendrite l’aumento di cAMP è seguito da incrementi di Ca2+.

Per vedere se questa stessa catena di eventi molecolari si verifica anche in seguito all’attivazione del recettore espresso all’assone terminale, abbiamo caricato i NSO con indicatori per il Ca2+ e stimolato selettivamente il recettore espresso all’assone terminale con odori.

In questo caso un incremento di Ca2+ è presente esclusivamente all’assone terminale.

I dati ottenuti in coltura dimostrano che il RO all’assone terminale è funzionante, capace di legare gli odori e associato a incrementi locali di cAMP e Ca2+.

Gli stessi risultati sono stati ottenuti con esperimenti in vivo, escludendo possibili artefatti legati alle condizioni di coltura e all’isolamento dei neuroni.

E’ stato osservato che i neuroni sensoriali olfattivi esprimenti RO diversi esprimono anche molecole guida diverse, che contribuiscono al targeting assonale insieme al RO. Rimane ancora oscura la connessione tra la presenza di un dato tipo di RO e l’espressione di specifiche molecole guida.

Il cAMP può esplicare la sua azione nei siti dove è prodotto ma anche a livello nucleare, utilizzando il suo target molecolare principale, la protein kinasi A (PKA), la quale è in grado di raggiungere ed entrare nel nucleo dove può modulare la trascrizione genica.

Per valutare se questo fenomeno può verificarsi anche nel nostro sistema, abbiamo stimolato selettivamente (con una pipetta) il RO espresso all’assone con odori e abbiamo valutato la presenza di PKA a livello del nucleo in seguito a questo trattamento.

Abbiamo osservato che, in seguito a stimolazione selettiva del RO espresso all’assone con odori, la PKA è presente nel nucleo.

Conclusioni:

I risultati ottenuti dal nostro studio dimostrano, per la prima volta, che il RO all’assone terminale è funzionante, capace di legare gli odori e associato a incrementi locali di cAMP e Ca2+.

Il cAMP prodotto in seguito all’attivazione del RO all’assone può esplicare la sua azione localmente, come dimostrato in altri sistemi.

E’ stato osservato, infatti, che i livelli di cAMP svolgono un ruolo chiave nel dirigere la traiettoria dell’assone in risposta a molecole guida presenti nell’ambiente.

Inoltre il cAMP può agire a livello nucleare, attraverso la traslocazione nucleare di PKA, regolando l’espressione di geni per molecole guida, che cooperano con il RO nella formazione della mappa sensoriale.

Rimane ancora aperta la domanda su quali siano i ligandi naturali in grado di attivare il RO all’assone terminale.

Alla luce dei risultati ottenuti è interessante pensare che gli odori possano esplicare questa azione. Essi sono a tutt’oggi gli unici ligandi noti capaci di attivare in modo selettivo più di mille RO diversi.

L’altra possibilità è che molecole presenti nel bulbo, ancora non identificate, siano in realtà i veri ligandi endogeni.

Al di là dei meccanismi con cui il recettore viene attivato all’assone, tema di future ricerche, i dati ottenuti costituiscono un elemento fondamentale per poter ulteriormente indagare le modalità con cui il recettore all’assone può esplicare la sua azione di molecola guida nell’organizzazione dei circuiti del SO.

I risultati ottenuti, importanti per capire l’organizzazione del SO, permettono di chiarire più in generale i meccanismi molecolari sottesi alla formazione dei circuiti nel sistema nervoso centrale.

Queste conoscenze sono fondamentali per capire la fisiologia del sistema ed eventuali alterazioni patologiche che possono manifestarsi sia nel corso dello sviluppo sia in patologie neurodegenerative e psichiatriche quali Alzheimer, Parkinson e schizofrenia, nelle quali il SO è precocemente e severamente colpito.

Sitografia:

Summary of fluorescent Ca{2+} indicators available from Molecular Probes - Table 19.1
www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook/tables/Summary-of-fluorescent-Ca2-indicators-available-from-Molecular-Probes.html

Note:

Sinapsi: struttura altamente specializzata che consente la comunicazione tra neuroni.

Sensore per cAMP: è rappresentato da una o più proteine unite a molecole fluorescenti. Queste strutture proteiche modificate sono in grado di entrare nella cellula (a seguito di processi di trasfezione) dove sono in grado di legare il cAMP. La fluorescenza del sensore varia a seconda che esso sia libero o legato a cAMP, in relazione alle concentrazioni di cAMP nella cellula. Quindi monitorando con tecniche di imaging le variazioni di fluorescenza del sensore è possibile monitorare le variazioni di cAMP all’interno della cellula stessa. Di sensori per cAMP ne sono presenti di vari tipi. Quello da noi utilizzato si basa sulla protein kinasi A (PKA).

In breve: la PKA, principale target del cAMP, è un enzima tetramerico, costituito da due sub unità regolatorie (R), che legano il cAMP e due sub unità catalitiche (C). Per fare il sensore per cAMP , la PKA è stata geneticamente modificata in modo che le sub unità regolatorie sono state fuse con CFP, mentre le sub unità catalitiche sono state fuse con YFP, entrambi molecole fluorescenti derivati di GFP. In condizioni di base, in cui le concentrazioni di cAMP sono basse, la PKA è presente nella cellula nella sua struttura olotetramerica, con le sub unità C vicine alle R. Per cui stimolando alla appropriata lunghezza d’onda il CFP delle sub unità regolatorie, questo emette a una lunghezza d’onda che è in grado di eccitare il YFP. Questo fenomeno è chiamato Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET. Quando nella cellula il cAMP aumenta in concentrazione, esso si lega alle subunità R della PKA inducendone un cambiamento conformazionale che libera le sub unità catalitiche. L’aumento di distanza tra le subunità C e R abolisce FRET.
Il FRET può essere agevolmente valutato, misurando il rapporto tra le emissione del CFP e del YFP (CFP/YFP). Monitorando quindi le variazioni di FRET è possibile monitorare le variazioni di cAMP nella cellula. Questa sonda presenta un’altissima risoluzione spaziale e temporale, permettendo così di valutare variazioni di concentrazione di cAMP in vari compartimenti sub-cellulari in tempo reale in cellule vive. Vedi schema fig. 9.

Indicatori per Ca2+: sono molecole fluorescenti in grado di entrare nella cellula e legare il Ca2+. La fluorescenza di questi indicatori varia in relazioni alle concentrazioni di Ca2+, di modo che monitorando la variazione di fluorescenza degli indicatori è possibile rilevare variazioni intracellulari di Ca2+. Link to molecular probes o simili

La ricerca presentata in queste pagine è finanziata da "The Giovanni Armenise-Harvard Foundation"

www.lswn.it/en/foundations/the_giovanni_armenise_harvard_foundation