Mini-organi umani e CRISPR per capire il cancro al fegato


    “Mini-organoidi” derivati da fegato umano modificati geneticamente attraverso CRISPR permettono di comprendere il ruolo chiave di geni mutati nello sviluppo di tumori.

    Cosa sono i mini-organi e come possiamo utilizzarli per la ricerca?

    Circa 10 anni fa isolando le cellule staminali intestinali e determinando le condizioni ideali per la loro crescita in vitro, il laboratorio del professor Hans Clevers in Olanda ha generato per la prima volta dei “mini-intestini” in coltura.

    Fornendo una serie di componenti essenziali e una matrice di supporto gelatinosa che riproduce un ambiente simile in una certa misura a quello presente nel tessuto d’origine, le cellule staminali sono in grado di generare delle piccole strutture tridimensionali che riproducono l’organizzazione del tessuto e contengono i vari tipi di cellule presenti nell’intestino.

     

    A partire da questa scoperta iniziale, dei “mini-organi” -anche detti organoidi- sono stati prodotti da cellule isolate da vari organi, compresi il pancreas, la vescica, il rene, la prostata, lo stomaco, il polmone, e il fegato.

    Utilizzando un piccolo frammento da tessuti di donatori umani, è stato possibile generare dei mini-organi umani, che chiaramente costituiscono una risorsa importante per la ricerca, anche perché sono “geneticamente stabili”, cioè non accumulano mutazioni in coltura con il passare del tempo, e quindi sono assimilabili alla condizione di un tessuto umano “sano”.

    I mini-fegati costituiscono pertanto un modello eccellente da utilizzare per comprendere i meccanismi che sono alla base di malattie ancora poco comprese, tra cui il cancro al fegato.

    Nuove tecnologie di “precision genome editing”, permettono di modificare il genoma cellulare in maniera controllata e pianificata, CRISPR in particolare funziona come delle piccole forbici molecolari e permette di creare dei tagli in sequenze specifiche del DNA delle cellule, e quindi attirando su questi siti il “macchinario di riparazione” del DNA della cellula stessa, inserire le mutazioni desiderate.

     

    Immagine di microscopia a fluorescenza che mostra da un lato un organoide di fegato “sano” a confronto con un organoide in cui il gene BAP1 è stato mutato attraverso CRISPRImmagine di microscopia a fluorescenza che mostra da un lato un organoide di fegato “sano” a confronto con un organoide in cui il gene BAP1 è stato mutato attraverso CRISPR. Da notare che gli organoidi in questo caso crescono come masse solide e protrusioni cellulari mediano la fusione tra organoidi vicini.

    Che cosa è stato fatto in laboratorio?

    Nel laboratorio di Hans Clevers i ricercatori si sono chiesti se fosse possibile utilizzare i mini-fegati umani sani per introdurre attraverso CRISPR le specifiche mutazioni genetiche che sono spesso presenti nei tumori, e quindi capirne il significato e il ruolo nel processo di formazione del tumore stesso.

    Questo tipo di esperimenti è particolarmente importante per il tumore del fegato. Questa patologia infatti è molto eterogenea, ovvero caratterizzata da una pletora di mutazioni che differiscono molto tra i vari pazienti, e tuttora l’effetto specifico di molte di queste mutazioni deve essere ancora compreso.  

    Ruolo degli organoidi nella ricerca sul cancro

    Gli organoidi sono già stati impiegati nella ricerca sul cancro da qualche anno. L’approccio principale è stato tuttavia quello di confrontare organoidi derivati da tessuti sani verso quelli generati a partire da tumori.

    Questi esperimenti possono essere molto utili per alcuni tipi di applicazioni, quali ad esempio per testare la sensibilità degli organoidi a delle terapie, ma non sono i più indicati per scoprire la funzione di geni coinvolti nello sviluppo del tumore stesso. Per questo tipo di studi, c’è bisogno di un sistema che permetta di colpire in maniera mirata un singolo gene per volta, e valutarne attentamente le conseguenze nel trasformare il tessuto sano in un tumore.

    Un gene chiamato BAP1 è critico per lo sviluppo del cancro al fegato

    Benedetta Artegiani, primo autore dello studio e ricercatrice all’Hubrecht Institute, e i suoi colleghi  hanno prima di tutto iniziato il loro lavoro cercando le condizioni ottimali per ingegnerizzare il genoma dei “mini-fegati” umani in coltura, grazie all’uso di CRISPR/Cas9, un sistema di efficienti e precise “forbici molecolari”.

    Una volta capito come riuscire a modificare i propri “mini-fegati”, i ricercatori hanno riprodotto alcune delle mutazioni che sono presenti nei tumori. Un gene in particolare, BAP1, è mutato in circa il 15% di tumori al fegato, ma la sua funzione è ancora non del tutto chiarita.

    Quando BAP1 è stato mutato, i ricercatori hanno assistito ad un drammatico cambiamento nei loro organoidi. Sono infatti divenuti delle masse solide in grado di crescere più rapidamente e in modo invasivo, con maggiore motilità e capacità di fondersi insieme per creare delle masse sempre più grandi.

    Utilizzando una serie di approcci differenti, che includono “imaging in tempo reale”, microscopia confocale ed elettronica, e avanzate analisi molecolari i ricercatori hanno capito che BAP1 controlla l’attivazione di una serie di altri specifici geni, e la sua mutazione causa un mancato controllo della loro attivazione, che si traduce nei drammatici cambiamenti osservati nei mini-fegati umani.

    Non solo, quando la funzione di BAP1 viene riattivata, gli organoidi tornano al loro aspetto e comportamento normale, e l’attivazione genica viene ripristinata. I ricercatori hanno inoltre chiarito che questi effetti e la funzione di BAP1 sembra essere cellula-specifica, ovvero è strettamente connessa al tipo di cellula e pertanto BAP1 potrebbe ricoprire altri ruoli in altri organi.

    Qual è tuttavia l’importanza di BAP1 per la formazione del tumore al fegato?

    Per rispondere a questa domanda Artegiani e colleghi hanno generato un modello più complesso, in cui una serie di geni comunemente alterati nel tumore sono stati mutati. In questo contesto genetico, BAP1 è stato mantenuto intatto o anch’esso inattivato.

    A questo punto, i mini-fegati cresciuti in presenza o assenza della mutazione di BAP1 vengono trapiantati in un modello di topo per capire le possibili differenze nella crescita del tumore. Mentre con BAP1 mutato gli organoidi crescono come dei tumori maligni, con il gene intatto sono solo in grado di generare degli adenomi, piccole formazioni benigne.  

    Un nuovo paradigma per studiare il tumore al fegato e i geni coinvolti

    Lo sviluppo di un modello umano di tumore e la capacità di dissezionare l’effetto specifico di singole mutazioni è uno step importante per comprendere la malattia e potrebbe avere un ruolo critico per capire l’effetto di ulteriori mutazioni, possibili effetti di sinergia e antagonismo tra diverse geni mutati e nel futuro per sviluppare possibili terapie personalizzate.

    In aggiunta, dimostrando che l’effetto della mutazione di BAP1 dipende dal tipo di cellula affetta, questo lavoro sottolinea anche l’importanza degli organoidi umani per studiare funzioni geniche, nell’organo, nella specie e nel contesto appropriato.

    Pubblicazione originale:

    Benedetta Artegiani, Lisa van Voorthuijsen, Rik G.H. Lindeboom, Daniëlle Seinstra, Inha Heo, Pablo Tapia, Carmen López-Iglesias, Daniel Postrach, Talya Dayton, Rurika Oka, Huili Hu, Ruben van Boxtel, Johan H. van Es, Johan Offerhaus, Peter J. Peters, Jacco van Rheenen, Michiel Vermeulenand Hans Clevers

    Probing the Tumour Suppressor Function of BAP1 in CRISPR-engineered Human Liver Organoids

    Cell Stem Cell, 2019 (in press)



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