L’acqua, il metronomo molecolare della fotosintesi?

Il percorso della ricerca

 

Domanda 1. Nel 2023, su Angewandte Chemie, avevate già osservato una cinetica bi-esponenziale per il passaggio CT1 (163 fs e 2 ps). Cosa vi ha spinto a tornare su quel risultato con un impianto multiscala con un’ampiezza maggiore, che aggiunge la dinamica quantistica TD-DMRG alle simulazioni classiche? Cosa mancava, nel quadro del 2023, che oggi riuscite a spiegare?

Il punto di partenza per approfondire la cinetica bi-esponenziale nel fotosistema-II è stato proprio il lavoro del 2023. Tuttavia, avevamo già osservato con interesse lo stesso comportamento per altri trasferimenti di carica in sistemi diversi. Quello che mancava, e che abbiamo aggiunto in questo lavoro, è la spiegazione del meccanismo molecolare alla base della biesponenzialità.

Abbiamo inoltre aggiunto la descrizione del trasferimento di energia attraverso la dinamica quantistica per costruire uno schema completo dei primi passaggi della reazione senza trascurare il ruolo della special pair, la coppia di clorofille che ha un ruolo fondamentale nella dinamica di trasferimento di energia e di separazione di carica del fotosistema-II.

D2. Il modello che proponete esclude sia il percorso ChlD1⁻ (termodinamicamente sfavorito) sia il canale diretto CT-LR. Rispetto al dibattito degli ultimi quindici anni, che aveva più volte riproposto l'idea di "due percorsi paralleli", quanto è stata netta questa esclusione? C'è stata resistenza, anche interna al gruppo, ad abbandonare tale ipotesi?

Nel nostro primo lavoro sul tema avevamo confrontato la termodinamica di tre possibili processi di separazione di carica primaria, osservando che due erano energeticamente plausibili mentre il terzo, che richiedeva la formazione di un intermedio con una clorofilla caricata negativamente (ChlD1⁻), risultava fortemente sfavorito.

Successivamente, valutando la cinetica dei due percorsi rimanenti, abbiamo osservato che quello relativo al canale a lungo raggio (CT-LR) era molto più lento rispetto all'altro. Questo ci ha portato a considerare un unico percorso chimico dominante per la separazione di carica primaria, ma caratterizzato da almeno due cinetiche differenti.

Dai risultati che abbiamo ottenuto, l'esclusione degli altri percorsi è abbastanza netta, almeno nelle condizioni che abbiamo simulato. In organismi diversi, a temperature o condizioni di illuminazione differenti, oppure in diversi stati di adattamento del fotosistema, non possiamo escludere a priori che possano diventare accessibili percorsi chimici alternativi.
 

Risultati, implicazioni e rilevanza

D3. Il cuore del lavoro è la distinzione fra fluttuazioni istantanee, guidate dalla proteina (in particolare dalle due eliche vicine alla coppia donatore-accettore), e fluttuazioni lente dell'energia media, dell'ordine delle decine di picosecondi, guidate invece dal solvente. Come siete arrivati a separare questi due contributi? E quale delle due osservazioni vi ha convinto per prima considerato che la vecchia prospettiva a "percorsi paralleli" non reggeva più?

L'osservabile computazionale che abbiamo seguito è l'energia di transizione, ovvero la differenza di energia tra lo stato eccitato e lo stato a carica separata della coppia donatore-accettore.

Quando questa differenza si avvicina allo zero, il trasferimento di carica diventa energeticamente accessibile. Attraverso l'approccio computazionale sviluppato nel nostro gruppo, il Perturbed Matrix Method (PMM), è possibile scomporre i contributi del potenziale elettrostatico dell'ambiente che fanno fluttuare l'energia di transizione.

In questo modo abbiamo osservato che le fluttuazioni della proteina contribuiscono soprattutto alle oscillazioni rapide dell'energia di transizione, mentre il solvente, in particolare l'acqua presente all'interno della proteina, modula le fluttuazioni più lente. Questi due regimi di fluttuazioni sono alla base della biesponenzialità della cinetica del trasferimento di carica. La possibilità che il solvente possa avere un ruolo attivo nella modulazione della velocità di una reazione è proposto anche in alcuni altri sistemi diversi dai fotosistemi.

I nostri risultati, che mostrano esplicitamente il ruolo dell’acqua nella cinetica del trasferimento di carica nel fotosistema-II, suggeriscono che fenomeni analoghi possano essere in realtà presenti in altri sistemi biologici, e quindi su una scala più vasta rispetto a quello che si pensava in precedenza. Nel fotosistema-II inoltre, questo effetto è particolarmente intrigante visto che il solvente, ovvero l’acqua, è anche il substrato stesso della reazione catalizzata. 

D4. Avete osservato che l'allargamento del canale d'acqua Cl1 verso la Tirosina Z, lo stesso residuo che innesca l'ossidazione dell'acqua nel complesso del manganese, corrisponde a un aumento dell'energia di transizione e quindi a un'accelerazione della separazione di carica. È un collegamento fra due funzioni della fotosintesi finora studiate separatamente. Come interpretate questo meccanismo? Si tratta di una coincidenza strutturale o come un meccanismo di regolazione reale, per esempio un modo per accoppiare i tempi della separazione di carica a quelli, più lenti, del ciclo di ossidazione dell'acqua?

Quello che osserviamo è che le molecole d'acqua interne al fotosistema-II contribuiscono in maniera importante alle variazioni lente dell'energia di transizione. E non sembra essere semplicemente una questione di quanta acqua è presente: conta soprattutto come le molecole d'acqua sono organizzate nello spazio all'interno dei canali, come nel caso della Tirosina Z.

La possibilità che questa non sia una coincidenza ma un meccanismo funzionale è un’ipotesi che abbiamo fatto quando abbiamo ottenuto questi risultati.

Considerando che il trasferimento di carica dalla special pair alla tirosina è uno degli eventi chimici immediatamente successivi alla separazione di carica primaria, sarebbe estremamente interessante riuscire a capire se esistono conformazioni della proteina e del solvente capaci di facilitare sia la separazione di carica iniziale, sia il successivo trasferimento verso la tirosina. Si potrebbe immaginare, in questo senso, una sorta di metronomo molecolare che contribuisce a scandire i tempi della reazione.

Ad oggi, tuttavia, la nostra resta solo un’ipotesi ed uno spunto interessante per ulteriori ricerche. 

 

D5. Il modello cinetico finale riproduce quattro tempi caratteristici (125 fs, 218 fs, 386 fs, 2,7 ps) a partire dalle costanti microscopiche, alcune delle quali riprese da lavori computazionali precedenti più che misurate direttamente in questo studio. Quanto è robusto il risultato rispetto a un cambiamento in uno di questi parametri, per esempio il tasso di interconversione fra i due regimi conformazionali?

La robustezza del modello è un punto cruciale. Va però considerato anche che i valori sperimentali delle costanti cinetiche presentano una certa variabilità, che dipende dalle condizioni di preparazione del campione, dall'organismo utilizzato, dalla temperatura e dai metodi di analisi dei dati sperimentali.

In questo contesto, anche una modesta variazione delle costanti microscopiche utilizzate nel modello potrebbe modificare i valori assoluti dei tempi caratteristici, pur lasciando invariata l'interpretazione generale dei diversi regimi cinetici.

In particolare, il parametro cruciale per mantenere la distinzione tra i due regimi è la velocità di interconversione tra le conformazioni del solvente che favoriscono una separazione di carica più veloce o più lenta. Questa interconversione è molto più lenta anche della componente più lenta della separazione di carica descritta dal modello.

Di conseguenza, i due regimi restano sostanzialmente distinti anche in presenza di moderate variazioni dei parametri. Questo non significa che ogni valore assoluto sia indipendente dalle approssimazioni adottate, ma che il quadro fisico generale risulta robusto rispetto a variazioni ragionevoli delle costanti microscopiche.
 

D6. Il metodo PMM su cui si basa gran parte del lavoro non propaga esplicitamente la funzione d'onda elettronica e non tratta la coerenza quantistica in modo completo.
Voi stessi segnalate che questo potrebbe essere un limite nei processi ultraveloci dominati da rilassamento intramolecolare. Quanto pensate che questa approssimazione possa incidere sul trasferimento specifico fra ChlD1 e Pheo descritto in questo lavoro? 

Questa è chiaramente una limitazione del nostro metodo, che nasce però dalla possibilità di includere nella descrizione del processo un numero molto elevato di configurazioni dell'ambiente circostante. Un approccio esplicitamente quantistico che trattasse in modo altrettanto dettagliato tutte queste configurazioni richiederebbe costi computazionali enormi, se non proibitivi.

L'assunzione alla base di questa scelta è che, per il processo che vogliamo descrivere, le fluttuazioni dell'ambiente circostante rappresentino il principale fattore di modulazione della reazione, mentre gli effetti della coerenza elettronica siano meno determinanti.

Per il trasferimento Chl_D1 → Pheo_D1 è stato dimostrato da lavori precedenti che questa approssimazione è ragionevole. Si tratta di un trasferimento intermolecolare, fortemente modulato dalle fluttuazioni della proteina e del solvente, e a temperatura fisiologica la coerenza elettronica è fortemente ridotta.

Quando abbiamo voluto investigare il trasferimento di energia tra le clorofille, che avviene su scale temporali estremamente rapide e per il quale la natura quantistica degli stati elettronici è importante, non potevamo invece trascurare questi effetti. Per questo abbiamo utilizzato la TD-DMRG, che ci ha permesso di descrivere la dinamica quantistica degli stati elettronici, accettando però una descrizione meno dettagliata dell'interazione con l'ambiente esterno.

Quando si intraprende uno studio teorico-computazionale, è inevitabile adottare delle approssimazioni e accettare dei compromessi, che devono essere dichiarati e discussi quando si condividono i risultati con la comunità scientifica. Nel nostro caso, l'accordo con le evidenze sperimentali rappresenta un elemento importante a sostegno della ragionevolezza delle approssimazioni adottate, pur non dimostrando che esse siano prive di limiti.

 

D7. Nel comunicato si parla di sistemi biomimetici in cui anche l'ambiente circostante partecipi al controllo delle reazioni. Concretamente, cosa cambierebbe nel progettare un dispositivo artificiale che sfrutti la riorganizzazione del solvente invece di limitarsi a riprodurre la disposizione dei pigmenti? È un'idea già testabile in laboratorio o resta per ora un principio ispiratore?

 

Il nostro è un filone di ricerca che cerca di comprendere il funzionamento dei macchinari molecolari che la Natura ha sviluppato nel corso di centinaia di milioni di anni di evoluzione.

I nostri risultati suggeriscono un principio interessante per la progettazione di sistemi artificiali: solvente, reti di legami a idrogeno e microambienti polari potrebbero essere considerati vere e proprie componenti funzionali del dispositivo, capaci di modificare nel tempo il paesaggio energetico della reazione.

Naturalmente, trattandosi di risultati teorico-computazionali, il nostro lavoro non dimostra ancora come realizzare concretamente un dispositivo di questo tipo. Fornisce però una base conoscitiva e alcuni possibili principi guida per il futuro design di sistemi biomimetici.

Il messaggio che porterei fuori da questo lavoro è che, quando si progetta un sistema per il trasferimento di carica, non bisogna pensare soltanto a dove collocare le molecole che scambiano l'elettrone, ma anche a come progettare l'ambiente nel quale queste molecole sono immerse.

Attualmente, molti approcci alla progettazione di catalizzatori artificiali per la fotosintesi si concentrano sulla composizione e sulla geometria strutturale dei materiali, per esempio degli ossidi metallici. Anche i MOF (Metal-Organic Framework), materiali porosi costituiti da reti di ioni metallici e molecole organiche, rappresentano una piattaforma interessante per la catalisi, grazie alla possibilità di controllarne la struttura e le proprietà chimiche.

Un possibile sviluppo futuro potrebbe essere proprio quello di sfruttare le cavità di questi materiali non soltanto per ospitare i siti catalitici, ma anche per organizzare in modo funzionale il solvente e le reti di legami a idrogeno al loro interno, cercando di riprodurre, almeno in parte, il ruolo che questi elementi sembrano svolgere nel fotosistema-II.

D8. Il lavoro nasce da una collaborazione che attraversa L'Aquila, Modena, Princeton e il Max Planck Institute. Come si coordina concretamente un progetto così distribuito, e quali competenze hanno portato in particolare i gruppi di Scholes (Princeton, dinamica quantistica) e Pantazis (Max Planck, calcoli QM/MM) rispetto alla parte italiana?

La chiave per coordinare un gruppo così distribuito sono gli incontri online, frequenti e ben strutturati. Le collaborazioni con Dimitrios Pantazis e con Greg Scholes erano già attive: proprio con Dimitrios era iniziato nel 2023 lo studio sul processo primario di trasferimento elettronico nel fotosistema-II, con Greg sui processi fotoindotti in enzimi non naturali.
In questo lavoro ho voluto allargare il punto di vista e unire le loro competenze. Da un lato quella di Dimitrios, tra i massimi esperti a livello mondiale del fotosistema-II; dall'altro quella di Greg, riferimento assoluto per i processi di trasferimento di energia, e di Alfy, dottorando a Princeton, che hanno curato i calcoli sul trasferimento di energia elettronica.

 

Gli scienziati dietro la ricerca

 

Q9. Dott. Capone, lei affianca alla ricerca il progetto di divulgazione "Il Chimico sulla Tavola". C'è qualcosa di questo studio, così tecnico e computazionale, che pensa si possa raccontare al grande pubblico senza semplificarlo eccessivamente fino a snaturarlo?

 

Qui esce fuori il comunicatore che c'è in me!

Non sono mai stato dell'idea che tutti debbano sapere tutto, e soprattutto che si possa fare divulgazione su ogni singolo tema specialistico. Al contrario, credo che riuscire ad accettare la complessità, e quindi comprendere che quasi mai esistono risposte semplici, sia una capacità necessaria per ogni cittadino che voglia essere consapevole di ciò che gli accade intorno.

Questo tipo di lavori permette di mettere in risalto un aspetto molto importante della scienza: la realtà è quasi sempre più complessa di quanto immaginiamo. Un po' come in un frattale, in cui ogni curva ne contiene una più piccola e altrettanto complessa, ogni risposta che la scienza riesce a trovare porta con sé nuove domande.

Bene, abbiamo un unico percorso dominante di separazione di carica, ma osserviamo due cinetiche differenti. Come mai? Scopriamo che questa differenza è legata all'eterogeneità dell'ambiente proteico e del solvente. Fantastico! Ma allora quanti altri sistemi esprimono un comportamento simile? E come possiamo sfruttare questa conoscenza a nostro vantaggio?

E così via, continuando a fare domande, finché la curiosità ce lo permette.

 

Q10. Dott.ssa Zanetti-Polzi, lei guida il progetto EnvELOP sull'ambiente molecolare delle rodopsine, un tema per certi versi vicino a questo lavoro: in entrambi i casi l'ambiente circostante non è uno sfondo passivo ma un attore della reazione. È diventato un filo conduttore della sua ricerca, o è una coincidenza fra due progetti diversi?

 

In effetti il ruolo dell’ambiente è un filo conduttore della mia attività. Non solo per quanto riguarda i processi reattivi, ma anche per quanto riguarda le proprietà spettroscopiche e termodinamiche dei sistemi macromolecolari sui quali lavoro solitamente. Ho potuto constatare nel tempo, anche su sistemi molto diversi tra loro, che l’accoppiamento tra processi di natura quantistica e l’ambiente in cui essi avvengono è spesso assolutamente non ovvio e difficile da predire senza uno studio dedicato. 

 

Q11. Prof.ssa Daidone, lei compare fra le autrici di riferimento per la corrispondenza di questo lavoro insieme ai proff. Scholes e Pantazis e alla Dott.ssa Zanetti-Polzi con un contributo che il paper indica in concettualizzazione, supervisione e scrittura. Il suo gruppo a L'Aquila aveva già pubblicato nel 2023, sempre su Angewandte Chemie, la prima osservazione di questa cinetica bi-esponenziale, con il Dott. Capone come primo autore. Quanto di questo nuovo lavoro nasce da un'idea che coltivava già allora, e cosa ha reso possibile solo ora (con l'aggiunta della dinamica quantistica TD-DMRG e la collaborazione con Princeton e Max Planck) il completamento quel quadro?

 

Decisamente da un'idea che coltivavo da anni. Praticamente tutti i sistemi proteici che conosco, mostrano cinetiche di trasferimento elettronico non mono-esponenziali. Un esempio emblematico sono le flavodossine e altri sistemi con cofattori flavinici studiati da Dongping Zhong, con cui ho una collaborazione attiva. I suoi esperimenti hanno mostrato comportamenti non esponenziali in praticamente tutti questi sistemi. Risalire all'origine di questa multi-esponenzialità è estremamente complesso. Ed è l’approccio sviluppato e usato da anni nel nostro gruppo, il PMM (Perturbed Matrix Method), a provare a dare una risposta. Infatti consente di disaccoppiare i diversi contributi dell'ambiente e quindi di risalire all'origine della non-esponenzialità e delle singole componenti cinetiche. Ma il quadro non si regge sul solo PMM. Lo studio del trasferimento di energia elettronica con Greg e i calcoli QM/MM dello stato eccitato con Dimitrios, ne sono stati il fondamento. Il primo ha aiutato a interpretare l'origine delle componenti temporali più veloci osservate negli esperimenti; i secondi hanno fornito dati accurati come input al PMM.

 

Q12.  Che cosa l'ha convinta a insistere per anni su un problema, la cinetica della separazione di carica in Fotosistema II, che la comunità scientifica dibatte da decenni senza arrivare a un consenso?

 

Proprio perché la comunità scientifica ne discute da anni. Il fotosistema-II è un sistema fondamentale ma anche molto complesso, e questo rende estremamente intricata l'interpretazione delle misure sperimentali. Per questo uno degli obiettivi principali della ricerca è stato interpretare le componenti cinetiche osservate negli esperimenti. In una seconda fase ci siamo dedicati ad assegnare queste componenti nell'intervallo di tempi del trasferimento elettronico primario. Questo tipo di lavori richiede molto tempo. Ciascuno dei due studi sul fotosistema-II che abbiamo già pubblicato ha richiesto vari anni. E non ci fermeremo qui.

 

 

Short bio

Laura Zanetti-Polzi è ricercatrice senior presso l’Istituto di Nanoscienze del Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR-NANO) di Modena. Ha studiato Fisica all’Università degli Studi di Roma “La Sapienza”, dove ha conseguito la Laurea nel 2006 e il Dottorato di ricerca in Biofisica nel 2010. Dopo il dottorato ha svolto attività di ricerca presso l’Università degli Studi dell’Aquila, il CNR-NANO e l’Università di Roma “Tor Vergata”, entrando stabilmente nel CNR nel 2019.
La sua attività di ricerca si concentra sullo studio teorico-computazionale dei sistemi biomolecolari. A questo scopo sviluppa e applica approcci ibridi quanto-classici e simulazioni di dinamica molecolare, combinando modelli teorici e simulazioni con dati sperimentali.

Isabella Daidone è professoressa ordinaria di Chimica presso l’Università degli Studi dell’Aquila. Ha conseguito la laurea magistrale in Chimica, con lode, presso l’Università di Roma “La Sapienza” nel 2001 e, nello stesso ateneo, ha ottenuto il dottorato di ricerca in Chimica nel 2004. Dal 2005 al 2008 ha svolto attività di ricerca post-dottorato in Germania, nel gruppo del prof. Jeremy C. Smith presso l’Università di Heidelberg, grazie a una borsa di studio europea Marie Curie. Nel 2009 è diventata ricercatrice presso l’Università dell’Aquila, per poi essere promossa a professoressa associata nel 2015. La sua attività di ricerca è incentrata sullo sviluppo e sull’applicazione di metodi computazionali per la descrizione di reazioni chimiche in sistemi biomolecolari.

Matteo Capone è ricercatore post-doc all’Università di Padova, e affiliato all'Istituto Nanoscienze del CNR. Laureato in Chimica con lode all’Università degli studi di Roma “La Sapienza” e ha conseguito il dottorato di ricerca in “Modelli Matematici” presso l’Università degli Studi dell’Aquila. La sua ricerca si concentra in particolare sulla fotosintesi e sulle proteine fotoattive, utilizzando simulazioni di dinamica molecolare e metodi di chimica quantistica per descrivere il ruolo dell'ambiente molecolare nelle reazioni ultraveloci. Dal 2020 cerca di portare la passione per la chimica dove ce n’è più bisogno col il progetto di divulgazione “I Chimici Sulla Tavola”.

Gianluca Dell'Orletta è dottorando in Chimica presso l'Università degli Studi dell'Aquila. Si occupa di chimica computazionale e dello studio dei processi fotoindotti in sistemi biologici