Intervista ad Andrea Mari ed Eleonora Grespan CNR


Studiati i meccanismi responsabili del difetto di secrezione insulinica nei pazienti diabetici. La ricerca, coordinata dall’Istituto di neuroscienze del CNR di Padova, migliora la comprensione di questa malattia integrando studi in vitro e in vivo e superando i limiti degli approcci puramente sperimentali. I risultati sono stati pubblicati sulla rivista ‘Diabetes’.

 

Abbiamo chiesto ad Andrea Mari ed Eleonora Grespan  (ricercatori e autori dello studio) di spiegarci nel dettaglio l'importanza dello studio.

Andrea Mari ed Eleonora Grespan ricercatori dell'Istituto di Neuroscienze del CNR. Credits: foto fornita dai ricercatori.Immagine - Andrea Mari ed Eleonora Grespan ricercatori dell'Istituto di Neuroscienze del CNR. Credits: foto fornita dai ricercatori.

1) Andrea Mari ed Eleonora Grespan sono ricercatori presso l’Istituto di neuroscienze del Cnr di Padova e coautori di uno studio pubblicato sulla rivista Diabetes dell’American Diabetes Association. Qual è nel dettaglio il vostro lavoro e lo specifico ambito di ricerca? Durante la vostra carriera come ricercatori qual è stato il motivo (o i motivi) che vi hanno spinto a iniziare lo studio del metabolismo glucosio-insulina?

AM (Andrea Mari): Ho studiato ingegneria elettronica e durante il corso di studi ho sviluppato un interesse specifico per le applicazioni in fisiologia e medicina. Mi sono spostato perciò da Trieste a Padova, dove c’era un gruppo di ricerca che si occupava dell’uso di modelli nello studio del metabolismo.

L’idea di base è quella di applicare i metodi che sono stati largamente studiati nell’ingegneria dei sistemi meccanici ed elettrici anche ai sistemi biologici.

Ho poi conseguito un dottorato in bioingegneria e mi sono appassionato soprattutto alla possibilità di descrivere i sistemi fisiologici con i modelli che consentono una comprensione più profonda di quello che sta succedendo.

Il tema della modellistica certamente non è nuovo, spesso però è trattato superficialmente, un po’ come un esercizio di applicazione di equazioni alla fisiologia mentre nella mia formazione e nel lavoro successivo ho cercato di avere una grandissima aderenza alla complessità e ai particolari della fisiologia, senza mai lasciare da parte gli aspetti matematici.

Occupandomi di metabolismo, lo studio del diabete ha avuto un ruolo chiave, data l’importanza e le proporzioni che ha assunto e continua ad assumere questa patologia.

 

EG (Eleonora Grespan): Ho studiato bioingegneria a Padova, spinta dal mio complementare interesse per gli aspetti matematici e per il mondo della medicina e della fisiologia. Una volta laureata, ho conseguito un dottorato di ricerca sperimentale in cui mi sono resa conto dell’importanza ma anche della complessità e dei limiti degli studi in vitro. Gli studi in vitro sono fondamentali per determinare meccanismi specifici, soprattutto a livello cellulare, ma non riescono a rappresentare la complessità della fisiologia in vivo.

D’altra parte, gli studi in vivo sono caratterizzati da protocolli sperimentali che non permettono di studiare in dettaglio il meccanismo cellulare ma solo la risposta nel complesso. Per queste ragioni mi sono resa conto dell’importanza degli aspetti modellistici per studiare, interpretare e unificare gli studi in vitro e in vivo.

Quando poi mi sono incontrata con Andrea Mari e il suo gruppo che sono degli esperti in questo campo per me è stata un’ottima opportunità per riprendere in mano le mie conoscenze che derivavano dall’università combinandole con le conoscenze sulla sperimentazione in vitro che avevo sviluppato nel dottorato e mi sono ritrovata a studiare la beta-cellula che rappresenta un ambito estremamente affascinante.

Infatti, nonostante sia studiato da molto tempo ci sono molti aspetti ancora non ben compresi e credo che il nostro lavoro possa dare un apporto importante all’incremento della conoscenza sui meccanismi di secrezione e di disfunzione della beta-cellula.

 

2) La vostra attività di ricerca sembra essere focalizzata sullo sviluppo e l’applicazione di metodi basati su modelli matematici per lo studio del metabolismo glucosio-insulina, in particolare per effettuare la valutazione della sensibilità all'insulina e della funzione beta-cellulare, ci potete spiegare nel dettaglio in cosa consistono le attività di ricerca che vengono svolte presso l’Istituto di Neuroscienze del CNR e quali sono i campi di applicazione?

AM: Il gruppo che si occupa di modellistica metabolica è un gruppo storico che precede la nostra presenza in quello che si chiama oggi Istituto di Neuroscienze; noi siamo confluiti nell’Istituto di Neuroscienze attraverso delle trasformazioni che sono avvenute all’interno del CNR. Gli indirizzi di ricerca dell’Istituto riguardano però le neuroscienze vere e proprie. Tuttavia io sono personalmente orgoglioso di fare parte di questo istituto perché è uno dei migliori del CNR.

In un certo senso, il nostro interesse per la cellula beta ha un rapporto con le neuroscienze in quanto le beta-cellule vengono considerate dei neuroni specializzati perché hanno dei meccanismi, soprattutto nella secrezione, analoghi ai meccanismi presenti nei neuroni. Nel nostro gruppo abbiamo investito specificatamente nella realizzazione di metodi per lo studio del metabolismo usando i modelli non in maniera distaccata dai problemi reali nella ricerca metabolica ma tenendo presente importanti aspetti applicativi.

Abbiamo sviluppato diversi metodi per la valutazione della sensibilità all’insulina, cioè della capacità che ha l’insulina di stimolare l’utilizzazione del glucosio e di sopprimere la sua produzione, che è uno degli aspetti importanti nel diabete. Abbiamo poi sviluppato un modello per la valutazione della funzione beta-cellulare in vivo a partire da un test semplice, il test classico del carico orale di glucosio.

Il modello dà una valutazione della funzione secretoria e ha avuto larga applicazione: noi abbiamo analizzato decine di migliaia di test nel corso della nostra storia. La relativa semplicità del test, e il suo impiego clinico per la valutazione della tolleranza al glucosio, che è fondamentale nella definizione del diabete, sono stati motivi di successo del nostro metodo.

Per questo motivo abbiamo avuto collaborazioni con tutto il mondo su problemi molto diversi di ricerca medica. Il modello è stato anche usato per la valutazione dell’efficacia di vari farmaci che agiscono sulla secrezione dell’insulina, in collaborazione con l’industria farmaceutica.

Al momento, con le nostre metodologie, partecipiamo a un progetto europeo in cui uno dei principali obiettivi è capire se metodi di valutazione delle caratteristiche individuali del paziente possono essere utili ai fini di una personalizzazione della terapia nel diabete di tipo due. Questo è un ambito molto più difficile di quanto non possa apparire. Ci sono però alcuni casi in cui si possono fare delle personalizzazioni per quel che riguarda il rischio di intolleranza a un farmaco.

 

3) Recentemente sulla rivista Diabetes è stato pubblicato lo studio “Defective Amplifying Pathway of β-cell Secretory Response to Glucose in Type 2 Diabetes: Integrated Modeling of in vitro and in vivo Evidence” riguardante i meccanismi responsabili del difetto di secrezione insulinica, fondamentale nello sviluppo del diabete di tipo 2, la forma più comune che interessa il 90% dei casi e che si sviluppa in modo prevalente a partire dai 40 anni di età. Ci spiegate di cosa tratta nel dettaglio lo studio che è stato pubblicato sulla rivista Diabetes e che cos’è il difetto di secrezione insulinica?

AM: Difetto di secrezione insulinica significa che le cellule beta del pancreas dei diabetici, per una certa concentrazione di glucosio nel sangue, non secernono la quantità di insulina che secernono le cellule normali. Il difetto di secrezione si sviluppa con il tempo: quando un soggetto non è ancora diabetico aumenta la secrezione per mantenere i livelli di glicemia sotto controllo e poi con il tempo la capacità secretoria diminuisce e in realtà il perché questo succeda non si sa ancora.

Si è caratterizzata questa riduzione della secrezione in vari studi clinici ma non si capiscono le cause di questo difetto. In tempi più recenti si è cercato di capire i meccanismi a livello cellulare studiando delle cellule generalmente di topo o di ratto. Oggi si usano anche cellule umane di donatori, perché le cellule dei roditori e dell’uomo sono molto simili ma non sono identiche, per esempio ci sono certi canali ionici che sono diversi.

Però i punti essenziali dei meccanismi sono gli stessi, e il modello di cellule di topo è tuttora considerato un buon modello, anche considerando le beta-cellule umane sono più difficili da ottenere e da conservare. Negli studi sulle beta-cellule di topo sono stati identificati due meccanismi a livello cellulare, che sono stati riportati nell’immagine dell’articolo, denominati “triggering pathway” e “amplyfing pathway”.

Nella ricerca in vitro, questi meccanismi sono considerati fondamentali nella secrezione insulinica, ma hanno avuto meno attenzione negli studi in vivo. In genere non c’è molta comunicazione tra chi fa ricerca in vitro e chi la fa in vivo: una ragione della separazione è che non si possono fare in vivo le cose che si fanno in vitro, non si può vedere cosa succede nella beta-cellula umana, che è inaccessibile quando una persona è in vita. Inoltre, anche usando cellule prese da donatori umani sani o diabetici il problema fondamentale è che non si può essere certi che le cellule usate in coltura si comportino come si comporterebbero in vivo.

Questo è un problema irrisolvibile. Noi abbiamo perciò pensato che per descrivere la secrezione di insulina, che ha una risposta quantitativa ben caratterizzata, fosse possibile usare un modello che spiega la secrezione nelle cellule e vedere come quel modello predice le risposte dei test che si usano tipicamente in vivo. Ed è questo che abbiamo fatto nel nostro lavoro: abbiamo preso alcuni studi fondamentali della letteratura in vitro, e con grande passione e determinazione io ed Eleonora abbiamo sviluppato un modello matematico che spiega le risposte che si osservano in varie condizioni.

Abbiamo poi usato lo stesso modello per predire la secrezione di insulina in vivo nei soggetti normali, in varie condizioni tipiche. Poi ci siamo chiesti che cosa può essere alterato nella risposta diabetica: le simulazioni con il modello hanno fatto vedere che il meccanismo che molto più probabilmente è alterato è quello che si chiama amplyfing pathway.

È stato identificato il difetto di questo meccanismo, mentre è improbabile che i difetti nel segnale del calcio (il triggering pathway) siano la causa della disfunzione diabetica. Dal punto di vista in vitro ci sono state un sacco di discussioni. Le persone tra i massimi esperti ci hanno anche citato quando questo lavoro era stato presentato in forma di poster perché le ricerche in vitro non sono in grado di chiarire del tutto se il difetto dei diabetici sia legato al triggering o all’amplifying pathway. Da qui l’importanza dell’uso di questo costrutto matematico per cercare di comprendere le cause del difetto nel diabete di tipo 2.

EG: Semplicemente ci tengo a rimarcare che uno degli aspetti veramente importanti di questo studio è che è il primo ad aver creato un ponte vero e proprio tra le conoscenze in vitro e quelle in vivo, perché il modello matematico è il modello di una cellula ma riproduce i dati che si ottengono da pazienti in vivo. Inoltre gli studiosi in vitro non hanno potuto determinare se è il triggering o l’amplifying pathway ad essere compromesso, e c’è molta discussione su questo aspetto. Il nostro modello propone che il difetto nel diabete di tipo 2 sia nell’amplifying e non nel triggering pathway. Anche questo è un aspetto innovativo dal punto di vista scientifico.

 

Immagine 2 - Spiegazione dello schema. Gli studi in vitro su isole pancreatiche e beta-cellule, prevalentemente di topo, hanno permesso di identificare i principali meccanismi cellulari responsabili della secrezione di insulina in risposta al glucosio (pannello A). L’ipotesi più avvalorata è quella della presenza di un pool di granuli di insulina immediatamente rilasciabili dalla cellula (IRP), che vengono secreti per mezzo di due meccanismi: l’aumento del calcio citosolico è il responsabile del meccanismo detto di attivazione (triggering pathway), mentre il metabolismo del glucosio permette la secrezione di insulina nella fase sostenuta per mezzo di meccanismi detti di amplificazione (amplifying pathway). In parallelo, gli studi in vivo hanno permesso di determinare i profili di secrezione in risposta a diversi stimoli di glucosio in soggetti sani e diabetici. Un esempio è la secrezione in risposta ad un gradino di glucosio, caratterizzata dalla presenza di una prima fase con secrezione che aumenta e decresce nei primi minuti e una seconda fase sostenuta (pannello B). Entrambe sono ridotte nel diabete di tipo 2. Tuttavia non era mai stato determinato come i meccanismi identificati negli studi in vitro riflettano la secrezione in vivo e quali siano i difetti cellulari nella condizione diabetica. Il nostro modello (pannello C) è stato realizzato basandoci sulle conoscenze in vitro e comprende l’IRP di granuli di insulina, il triggering pathway che permette il processo di esocitosi di granuli e l’amplifying pathway che assicura il rifornimento di granuli nell’IRP. Gli ingressi del modello sono: il glucosio che è lo stimolo principale per innescare la secrezione di insulina sia negli studi in vitro che in vivo ed è sempre noto, e il calcio. Il segnale del calcio è misurato negli studi in vitro mentre per riprodurre gli studi in vivo abbiamo realizzato un ulteriore modello matematico che permette di determinare il segnale del calcio a partire dal glucosio (non mostrato nello schema). Il modello permette di riprodurre vari dati sperimentali sia in vitro che in vivo. In particolare, per quanto riguarda i dati in vivo è capace di riprodurre la secrezione in risposta a vari tipi di test: clamp iperglicemico, rampa di glucosio, test orale di tolleranza al glucosio, bolo di glucosio. Il modello riesce inoltre a riprodurre diverse condizioni patologiche (pannello D). In particolare l’aumento della prima fase di secrezione nell’insulino resistenza (pannello D.1, linea arancione) è riprodotto ipotizzando un aumento dell’amplifying pathway a glucosio basale che si riflette in un aumento della dimensione dell’IRP e quindi in un aumento della secrezione nei primi minuti dopo uno stimolo di glucosio. La riduzione della prima fase della secrezione in risposta a iperglicemia basale (pannello D.2, linea arancione) viene riprodotta dal modello perché un aumento della glicemia basale porta ad un aumento della secrezione basale e quindi a una riduzione della dimensione dell’IRP. Quando c’è uno stimolo di glucosio, la prima fase è pertanto ridotta. Infine il modello riesce a riprodurre la condizione diabetica (pannello D.3, linea arancione) in cui la riduzione della prima fase deriva dall’iperglicemia basale che, come spiegato prima (pannello D.2) determina una riduzione della prima fase di secrezione in risposta ad uno stimolo. Nel diabete di tipo due anche la seconda fase è ridotta e il nostro modello mostra come questo puo’ essere spiegato ipotizzando una riduzione dell’amplifying pathway nei soggetti diabetici. In tutte le condizioni descritte il triggering pathway è invece inalterato rispetto ai soggetti sani. Il modello pertanto permette di unificare i meccanismi identificati in vitro con le risposte secretorie ottenute da test in vivo e mostra come la condizione diabetica può essere spiegata da un difetto nei meccanismi di amplificazione e non da un difetto del segnale calcio.

 

 

4) Ci spiegate in che modo sono stati combinati i dati degli studi in vivo e quelli degli studi in vitro, quali sono state le criticità nello sviluppare un modello matematico che rappresenta i meccanismi secretori della beta-cellula normale e i risultati che sono stati raggiunti con la vostra ricerca?

AM: Il processo nel combinare i dati non è stato semplice. L’idea che sta alla base dei modelli di sistemi biologici è quella di creare delle rappresentazioni che hanno l’ambizione di spiegare fenomeni molto complessi. Tuttavia, se uno dovesse descrivere ogni singolo aspetto del sistema biologico si otterrebbero dei modelli intrattabili e inutilizzabili.
Ciò che noi abbiamo come nostra filosofia è di sviluppare i modelli puntando a distillare quelli che sono i meccanismi essenziali, il che richiede una visione dei meccanismi nel loro complesso, la capacità di distinguere quelli che sono dettagli da quelli che sono fenomeni essenziali e la capacità di descriverli in modo matematico. Lo sviluppo di questo lavoro è stato un percorso lungo.
Eleonora ha portato a conclusione un modello che io a spizzichi e bocconi avevo cominciato molti anni fa quando mi ero appassionato alla fisiologia cellulare. Purtroppo la ricerca ha delle difficoltà, in Italia in particolare ma non solo: spesso le cose più interessanti non avvengono nell’ambito di progetti consolidati che però portano fondi e richiedono un sacco di energie ma avvengono in quello che uno riesce a fare in libertà, seguendo le proprie convinzioni.

Francamente ritengo che la libertà sia fondamentale; certo abbiamo il problema dei fondi ma guardando la storia è la libertà che ha permesso di fare i grandi passi.

 

5) Il modello matematico che è stato utilizzato nello studio potrebbe essere applicato per studiare i meccanismi biologici di altre malattie oltre al diabete?

AM: Il modello si riferisce in maniera specifica ai meccanismi di secrezione della beta-cellula. Ci possono essere delle comunanze dei meccanismi secretori con altre cellule, ma credo che il triggering pathway e l’amplifying pathway siano specifici della beta-cellula e quindi non c’è una estendibilità immediata ad altri settori.

EG: A meno che non si tratti di patologie che vanno ad inficiare la secrezione beta-cellulare.

AM: Certo, questo può essere. Ci possono essere altre forme di disfunzione della secrezione della beta cellula oltre al diabete di tipo 2. Per esempio il diabete di tipo 1 o il diabete dovuto a mutazioni genetiche particolari.

6) Il vostro studio avrà un impatto positivo sulle terapie per trattare il diabete?

AM: Lo studio può servire a identificare i meccanismi che contengono l’essenza del difetto e quindi ad identificare dei target farmacologici, ma presumibilmente in tempi non brevi.



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