Il meccanismo anti-tumorigenico dell’oncogiano MTND1.


    Autori: Giuseppe Gasparre e Anna Maria Porcelli

    ABSTRACT:

    Il ruolo delle mutazioni nei geni a codifica mitocondriale nella progressione tumorale è ambiguo. Studi funzionali mirati a stabilire il potenziale tumori genico di tali mutazioni non tengono conto delle peculiarità genetiche del cromosoma mitocondriale, ovvero la sua fisiologica poliploidia che porta alla coesistenza di genotipi mutati e selvatici in percentuali continuamente variabili, ed all’effetto soglia. Questa ricerca dimostra che quando questi parametri sono considerati, i geni mitocondriali, se mutati, mostrano un comportamento bivalente nella progressione tumorale, da cui la definizione di oncogiano. Infatti, solo sopra una ben definita soglia di carico mutazionale, la mutazione riesce a inibire la via mitocondriale per la produzione di energia cellulare, arrestando la crescita.

    IMPORTANZA DELLA RICERCA:

    La ricerca reinterpreta il ruolo delle mutazioni nel genoma mitocondriale nel processo di progressione tumorale, aggiungendo una definizione funzionale ad alcuni geni metabolici il cui effetto bivalente nella tumorigenesi dipende dall’effetto soglia del carico mutazionale. Inoltre, decifrando il meccanismo biochimico per cui, superata la soglia di mutazione, l’oncogiano diviene letale per la cellula tumorale si individua un preciso bersaglio terapeutico.

    STATO DELL’ARTE:

    Da quasi un secolo, la caratteristica metabolica principale delle cellule tumorali è considerata quella di preferire, anche in condizioni di aerobiosi, l’utilizzo della via glicolitica piuttosto che quella della respirazione mitocondriale, per la produzione di energia cellulare (Warburg 1956).

    Sebbene tale via sia meno efficiente e richieda un apporto di nutrienti, in particolare di glucosio, maggiore che la respirazione, si ritiene che possa trattarsi di un comportamento obbligato, per le cellule tumorali. Alternativamente, si ritiene che possa comportare vantaggi in termini di dirottamento dei metaboliti intermedi verso le vie anaboliche, ovvero che lo spegnimento della respirazione permetta alla cellula di sintetizzare più velocemente i mattoni di cui ha bisogno per dividersi e proliferare in maniera incontrollata.

    Il ruolo dei geni che controllano i processi energetici è dunque fondamentale nel determinare i cambiamenti metabolici di cui una cellula tumorale necessita sia per proliferare, sia per adattarsi all’ambiente tumorale che diviene, nel corso della progressione, sempre meno adatto alla crescita. Infatti la crescita incontrollata comporta l’acidificazione del microambiente, la scarsità di nutrienti ed in particolare quella di ossigeno, ovvero si instaura una condizione di ipossia.

    Affinché la massa tumorale possa continuare a crescere e metastatizzare, le cellule devono superare l’empasse dell’ipossia e attivare meccanismi molecolari che portino alla sintesi di nuovi vasi sanguigni (neoangiogenesi), un processo regolato dalla proteina HIF1, o fattore ipossia-indotto (Brahimi-Horn et al.2010)

    Alcuni geni metabolici sono noti per essere responsabili di tumori come alcuni tipi di carcinoma renale, proprio perché quando mutano e perdono la loro funzione facilitano l’adattamento all’ipossia, stabilizzando la proteina HIF1 (King et al. 2006) . La definizione, per questi geni (quali SDH ed FH), di oncosoppressori, è senz’altro appropriata, ma applicabile a geni codificati dal nucleo cellulare, ovvero quelli ad eredità mendeliana e presenti in duplice copia.

    Sebbene pochissimi, i geni codificati dal cromosoma mitocondriale non seguono la genetica mendeliana, poiché presenti in migliaia di copie in ogni cellula. Si tratta comunque di geni il cui ruolo nel metabolismo è fondamentale poiché da essi dipende quasi interamente la respirazione mitocondriale.

    Mutazioni in questi geni poliploidi che danneggiano le funzioni della fosforilazione ossidativa mitocondriale sono state fino ad oggi considerate pro-tumorigeniche, in particolare per il loro presunto ruolo nella produzione di specie radicaliche dell’ossigeno che contribuirebbero all’accumulo di danno genetico (Ishikawa et al. 2008).

    Tuttavia nel tentativo di attribuire un ruolo funzionale alle mutazioni del DNA mitocondriale (mtDNA) nella progressione tumorale si è scarsamente o per nulla tenuto conto delle peculiarità della genetica mitocondriale, della poliploidia dei geni e del grado di mutazione nell’espressività del fenotipo patologico.

    LA RICERCA:

    Per comprendere se mutazioni del genoma mitocondriale a carico di geni del complesso I influenzino il potenziale tumorigenico di cellule tumorali, sono state ingegnerizzate cellule di osteosarcoma tramite il processo di ibridazione (Fig.1).

    Fig.1Fig. 1 - Le cellule di osteosarcoma umano vengono depletate del mtDNA ottenendo così le cellule Rho-0

    Fig.1- Le cellule di osteosarcoma umano vengono depletate del mtDNA ottenendo così le cellule Rho-0 che posseggono il nucleo delle cellule di osteosarcoma e mitocondri senza mtDNA. Parallelamente le cellule con i mitocondri con mtDNA mutato, vengono depletate del loro nucleo ottenendo i citoplasmi. Questi ultimi sono poi mescolate con le cellule Rho-0 ottenendo i cibridi che sono cellule con nucleo di osteosarcoma e mitocondri con mtDNA mutato.

    L’osteosarcoma depleto del proprio contenuto di mtDNA è stato ripopolato con mitocondri contenenti diversi livelli di mutazione (eteroplasmia) 3571insC nel gene MTND1. Tale mutazione, comune nei tumori oncocitari, impedisce la traduzione della proteina mitocondriale generando un codone di stop prematuro e bloccando l’assemblaggio del complesso I.

    Cellule di carcinoma tiroideo e di osteosarcoma con diversi livelli (0, circa 60, 84 e circa 100%) di eteroplasmia sono state inoculate in topi immunodeficienti per osservare lo sviluppo tumorale in vivo. Le cellule con la mutazione al 100% di carico, ovvero quelle omoplasmiche, hanno mostrato una crescita nulla o molto bassa, rispetto a quelle eteroplasmiche o completamente wild-type per il gene MTND1 (Fig.2), indipendentemente dall’origine del tumore.

    Fig.2 (click su immagine per zoom +)Fig. 2 - Crescita delle cellule tumorali dopo inoculo nei topi immunodeficienti

    Fig.2 - Crescita delle cellule tumorali dopo inoculo nei topi immunodeficienti. (A) Cellule di carcinoma tiroideo wild-type (CCT wt) e con un carico mutazionale 100% (CCT omo); (B) Cellule di osteosarcoma wild-type (COS wt) e con un carico mutazionale 100% (COS omo).

    Ad una attenta analisi delle singole curve di crescita dei tumori impiantati, si è osservata eterogeneità di sviluppo tumorale in termini di volume finale della massa neoplastica. In maniera non lineare, la capacità di formare un tumore di dimensioni superiori al centimetro cubo correlava con una soglia di eteroplasmia inferiore all’83% (Fig.3), indicando che in una cellula quando 4 copie su 5 di cromosomi mitocondriali presentano la mutazione, il potenziale tumorigenico della cellula tumorale è notevolmente ridotto.

    Fig.3 (click su immagine per zoom +)Fig. 3 - Distribuzione dei volumi delle masse tumorali sviluppate in topi immunodeficienti e dei relativi valori di eteroplasmia

    Fig.3 – Distribuzione dei volumi delle masse tumorali sviluppate in topi immunodeficienti e dei relativi valori di eteroplasmia della mutazione nell’oncogiano MTND1 che mostra la percentuale soglia affinchè la crescita venga ridotta (<1 cm3).

    La riduzione del potenziale tumorigenico delle cellule con la mutazione omoplasmica non è dovuta ad una maggiore sensibilità di queste cellule alla morte cellulare per apoptosi ma alla degradazione della proteina HIF1 nonostante la condizione di ipossia locale (Fig.4A e 4B). Inoltre, a causa della mancanza di questa proteina, le cellule con la mutazione omoplasmica hanno mostrato bassi livelli di espressione dei geni che codificano per le proteine GLUT1, LDHA e VEGF (Fig. 4C), necessarie per il metabolismo glicolitico e per la neovascolarizzazione e quindi per la crescita del tumore.

    Fig.4 (click su immagine per zoom +)Fig. 4

    Fig.4 - (A) Dimostrazione per analisi immunoistochimica che il disassemblaggio del CI (colorazione negativa) avviene nei tumori con la mutazione sopra soglia e corrisponde all’assenza di HIF1 (T3) mentre nei tumori sotto soglia (T11) entrambe le colorazioni sono positive. (B) Il fenomeno di destabilizzazione di HIF1 non dipende dall’ipossia locale, infatti i tumori sopra soglia pur essendo più piccoli sono anche più ipossici, secondo la colorazione con pimonidazolo (in verde), marcatore di ipossia reale in vivo. (C) La sovraregolazione dei geni dipendenti da HIF1 avviene nei tumori sotto soglia, indicando che solo questi sono capaci di adattarsi all’ipossia. (D) Il rapporto α-KG/succinato è statisticamente più elevato nei tumori sopra soglia, di circa 3 volte, spiegando la destabilizzazione cronica di HIF1.

    E’ noto che un aumento dei livelli di α-chetoglutarato (α-KG), un metabolita del ciclo di Krebs, causa la degradazione di HIF1 (Tennant et al. 2009).

    La misura dei livelli di questo metabolita mostrava un chiaro accumulo nelle cellule con la mutazione omoplasmica (Fig. 4D). Questo risultato mostrano chiaramente che le cellule con la mutazione omoplasmica senza il complesso I non possono consumare il NADH prodotto dalla glicolisi e dal ciclo di Krebs. Inoltre, il NADH accumulato blocca il ciclo di Krebs nel punto in cui α-KG è trasformato in succinato (Berg et al., 2005).

    Questo blocco determina l’accumulo di α-KG e causa la degradazione di HIF1 e la mancanza di crescita del tumore.

    CONCLUSIONI:

    I geni a codifica mitocondriale sono essenziali per la respirazione cellulare e per il metabolismo energetico che sostiene la crescita tumorale. Tuttavia, poiché seguono regole non mendeliane di trasmissione e sono in multipla copia, non si può definire un ruolo di oncogene o di oncosoppressore classico.

    La ricerca dimostra che il carico mutazionale in geni che codificano per proteine del complesso I della catena respiratoria determina effetti opposti sulla crescita tumorale. Sopra una soglia definita, il danno è tale che la respirazione non può essere utilizzata per i processi anabolici. Allo stesso tempo, il disassemblaggio del complesso I, bloccando il consumo di NADH, causa anche una condizione di pseudonormossia che impedisce al tumore di adattarsi alla crescente ipossia generata nel microambiente (Gasparre et al. 2011).

    Poiché questo adattamento è necessario a compensare la diminuzione del metabolismo respiratorio con quello glicolitico anaerobio, la cellula tumorale finisce in un ‘vicolo cieco’ in cui non ha vie anaboliche percorribili (Gasparre et al. 2011).

    La demolizione per via genetica del complesso I, o l’inibizione completa della sua attività di ossidazione del NADH, con conseguente accumulo del metabolita o dell’α-KG, ottenibile per via farmacologica, potrebbero divenire efficaci strategie anti-cancro.

    BIBLIOGRAFIA

    Berg, M.J., Tymoczko J.L., and Stryer L. 2005. Biochimica. Edizione Zanichelli

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    Gasparre, G., Kurelac, I., Capristo, M., Iommarini, L., Ghelli, A., Ceccarelli, C., Nicoletti, G., Nanni, P., De Giovanni, C., Scotlandi, K., Betts, C.M., Carelli, V., Lollini, P.L., Romeo, G., Rugolo, M., and Porcelli, A.M. 2011. A Mutation Threshold Distinguishes the Antitumorigenic Effects of the Mitochondrial Gene MTND1, an Oncojanus Function. Cancer Res 71(19): 6220-6229.

    Gasparre, G., Romeo, G., Rugolo, M., and Porcelli, A.M. 2011. Learning from oncocytic tumors: Why choose inefficient mitochondria? Biochim Biophys Acta 1807(6): 633-642.

    Ishikawa, K., Takenaga, K., Akimoto, M., Koshikawa, N., Yamaguchi, A., Imanishi, H., Nakada, K., Honma, Y., and Hayashi, J. 2008. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis. Science 320(5876): 661-664.

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    Tennant, D.A., Frezza, C., MacKenzie, E.D., Nguyen, Q.D., Zheng, L., Selak, M.A., Roberts, D.L., Dive, C., Watson, D.G., Aboagye, E.O., and Gottlieb, E. 2009. Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death. Oncogene 28(45): 4009-4021.

    Warburg, O. 1956. On the origin of cancer cells. Science 123(3191): 309-314.



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