Interazione fisica e funzionale tra le proteine coinvolte nell’anemia di Fanconi e l’apparato di replicazione del DNA


    [ONLINE LA TERZA E ULTIMA PARTE] ABSTRACT La via di segnalazione dell’anemia di Fanconi (FA) gioca un ruolo cruciale nel mantenimento dell’integrità genomica nelle cellule eucariote. La sua inattivazione porta alle conseguenze fenotipiche tipiche della FA, una rara, ma molto grave sindrome umana ereditaria, caratterizzata da anomalie nello sviluppo che riguardano lo scheletro, i reni ed il cuore. I pazienti FA hanno un’età media di 20 anni, principalmente a causa dell’insufficienza midollare e dell’insorgenza di tumori maligni, specialmente leucemie mieloidi acute. A livello cellulare le caratteristiche distintive e diagnostiche della FA sono l’instabilità cromosomica e la sensibilità cellulare ad agenti che causano un legame covalente delle due eliche del DNA (detto DNA interstrand crosslink, ICL) quali la mitomicina C, il diepossibutano ed il cisplatino (ampliamente usati in chemioterapia). In seguito ad esposizione a questi agenti genotossici, cellule derivanti da pazienti FA mostrano un aumento di aberrazioni cromosomiche, quali rotture e fusioni di cromosomi. Ci sono almeno 13 distinti gruppi di complementazione FA, i cui geni corrispondenti sono stati identificati. Benchè la suo precisa funzione molecolare rimanga poco chiara, un modello generale sta emergendo che vede il pathway FA svolgere un ruolo fondamentale nella risposta ai danni al DNA in seguito a formazione di ICLs o comunque di lesioni che bloccano la replicazione del DNA. Uno studio svolto da Emanuela Tumini e coordinato da Federica Marini, in collaborazione con Marco Muzi Falconi e Paolo Plevani, Università degli Studi di Milano, ha identificato una nuova interessante connessione tra l’apparato di replicazione del DNA e le proteine coinvolte nell’anemia di Fanconi (Tumini et al.).

    PERCHÈ È IMPORTANTE L’ARTICOLO

    È estremamente importante comprendere il meccanismo d’azione del pathway responsabile dell’anemia di Fanconi, in quanto è ormai chiaro che questo svolge un ruolo chiave nella riparazione del DNA, nel mantenimento della stabilità del genoma e nel prevenire l’insorgenza di tumori.

    STATO DELL’ARTE E STUDI PRECEDENTI

    L’anemia di Fanconi (FA) è una rara sindrome autosomica recessiva o legata al cromosoma sessuale X, clinicamente caratterizzata da progressiva insufficienza del midollo osseo, pancitopenia, malformazioni congenite, ed elevata predisposizione allo sviluppo di tumori (soprattutto mielodisplasie e leucemie mieloidi acute).

    Questa malattia è anche definita sindrome da instabilità cromosomica, poiché a livello cellulare è contraddistinta dalla presenza di aberrazioni cromosomiche e frequenti rotture spontanee dei cromatidi.

    Caratteristica distintiva, infatti, di cellule con mutazioni che determinano la FA, è l'estrema sensibilità al trattamento con agenti che inducono Interstrand Crosslinks (ICLs) (de Winter and Joenje, 2009; Thompson and Hinz, 2009). Gli ICLs costituiscono una gravissima categoria di danno al DNA; essi legano covalentemente i due filamenti di una molecola di DNA e, impedendone la separazione, bloccano i processi vitali della cellula come la replicazione e la trascrizione.

    Per questo motivo gli ICLs sono particolarmente tossici per le cellule con alti ritmi di proliferazione e agenti chimici che provocano questi danni sono fra i farmaci citotossici più efficaci utilizzati in chemioterapia (McHugh et al., 2001). Da ciò si deduce l’importanza del comprendere come siano riparati gli ICLs.

    La via di segnalazione FA (Figura - 1) sembra svolgere un ruolo essenziale nella risposta a questi tipi di danni che bloccano la replicazione del DNA. Almeno 13 fattori proteici ne fanno parte e di questi 8 costituiscono un complesso nucleare detto core con attività E3 ubiquitin ligasica, attivato con un meccanismo dipendente dalla replicazione e dal danno al DNA.

    Questo complesso core FA possiede un eterodimero con attività di legame e movimento sul DNA e una subunità E3 ubiquitin ligasica, ed è necessario per la mono-ubiquitinazione delle proteine effettrici FANCD2 e FANCI, in seguito a stress genotossici. Dopo la modificazione, il dimero FANCD2-FANCI localizza con altre proteine coinvolte nella riparazione del DNA in zone di danno al DNA (Thompson and Hinz, 2009).

    Come effettivamente, però, le proteine FA contribuiscano alla rimozione della lesione dal DNA non è ancora chiaro.

    Figura - 1 - La via di segnalazione FA

    Figura - 1 - La via di segnalazione FA. Il complesso core FA lega il DNA grazie al dimero FANCM (M)/FAAP24 ed al complesso delle GINS, essenziale per la replicazione del DNA. FANCF (F) è una proteina flessibile, con ruolo chiave per l’assemblaggio del complesso e per il legame con il complesso GINS. In presenza di ICLs o di lesioni che bloccano la replicazione del DNA, il complesso core FA si attiva ed ubiquitina il dimero FANCI (I) e FANCD2 (D2) che, cosi’ modificato, localizza a livello del danno al DNA. Il dimero I/D2 viene anche fosforilato dalle proteine chinasi ATR ed ATM in risposta ai danni al DNA. La corretta attivazione del pathway è essenziale per la riparazione dei danni al DNA e per prevenire l’instabilità genomica.

    CORPO DEL TESTO

    Secondo un modello generale, la via di segnalazione FA costituisce parte della risposta al danno al DNA innescata dagli ICLs o comunque da lesioni che bloccano la replicazione del DNA.

    Al fine di comprendere meglio le funzioni cellulari del complesso core FA in risposta al danno al DNA, nel nostro laboratorio abbiamo cercato proteine che interagissero con FANCF, una proteina facente parte del complesso core FA. Tra le proteine del complesso, FANCF è una proteina flessibile che funge da ponte tra diversi sub-complessi.

    Inoltre, la mancata espressione del gene FANCF è stata correlata ad alcuni tumori all’ovario, al polmone ed alla cervice uterina, suggerendo che FANCF possa essere considerato un onco-soppressore (Marsit et al., 2004; Narayan et al., 2004; Taniguchi et al., 2003). Tra i candidati identificati, abbiamo focalizzato i nostri studi su PSF2, un membro del complesso di quattro subunità chiamato GINS, essenziale sia per la fase d’inizio sia per quella di allungamento della replicazione del DNA (Labib and Gambus, 2007).

    Abbiamo scoperto che il complesso GINS è essenziale per caricare il complesso core FA sulla cromatina. Abbiamo, infatti, osservato che le GINS ed il core FA legano il DNA contemporaneamente, all’inizio della fase di sintesi del DNA, anche in assenza di DNA danneggiato.

    Al contrario, il complesso core FA non sembra essere necessario per il legame delle GINS al DNA. In accordo con questi dati, abbiamo dimostrato che la mancata espressione di PSF2 nelle cellule causa un aumento di sensibilità ad agenti che causano ICLs, similmente a mutazioni nei geni FA.

    TERZA PARTE

    CONCLUSIONI

    La corretta attivazione della via di trasduzione del segnale FA è essenziale per riparare gli ICLs e altre lesioni che bloccano la replicazione del DNA.

    Il suo malfunzionamento porta inevitabilmente ad instabilità genomica ed all’insorgenza di tumori, come dimostrano i pazienti stessi affetti dall’anemia di Fanconi. Evento chiave nella via di segnalazione è il legame del complesso core FA al DNA durante la replicazione del DNA ed in seguito a danni al DNA.

    Il dimero FANCM/FAAP24, facente parte del complesso core stesso, svolge un ruolo essenziale nel reclutare il resto del complesso sul DNA.

    Col nostro lavoro abbiamo dimostrato che anche il complesso delle GINS, essenziale sia nella fase di inizio che di allungamento della replicazione del DNA, ha una grande importanza nel portare il complesso core sul DNA durante la replicazione, grazie proprio all’interazione tra FANCF e PSF2.

    BIBLIOGRAFIA

    de Winter, J.P., and Joenje, H. (2009). The genetic and molecular basis of Fanconi anemia. Mutat Res 668, 11-19.

    Labib, K., and Gambus, A. (2007). A key role for the GINS complex at DNA replication forks. Trends Cell Biol 17, 271-278.

    Marsit, C.J., Liu, M., Nelson, H.H., Posner, M., Suzuki, M., and Kelsey, K.T. (2004). Inactivation of the Fanconi anemia/BRCA pathway in lung and oral cancers: implications for treatment and survival. Oncogene 23, 1000-1004.

    McHugh, P.J., Spanswick, V.J., and Hartley, J.A. (2001). Repair of DNA interstrand crosslinks: molecular mechanisms and clinical relevance. Lancet Oncol 2, 483-490.

    Narayan, G., Arias-Pulido, H., Nandula, S.V., Basso, K., Sugirtharaj, D.D., Vargas, H., Mansukhani, M., Villella, J., Meyer, L., Schneider, A., et al. (2004). Promoter hypermethylation of FANCF: disruption of Fanconi Anemia-BRCA pathway in cervical cancer. Cancer Res 64, 2994-2997.

    Taniguchi, T., Tischkowitz, M., Ameziane, N., Hodgson, S.V., Mathew, C.G., Joenje, H., Mok, S.C., and D'Andrea, A.D. (2003). Disruption of the Fanconi anemia-BRCA pathway in cisplatin-sensitive ovarian tumors. Nat Med 9, 568-574.

    Thompson, L.H., and Hinz, J.M. (2009). Cellular and molecular consequences of defective Fanconi anemia proteins in replication-coupled DNA repair: mechanistic insights. Mutat Res 668, 54-72.

    Tumini, E., Plevani, P., Muzi-Falconi, M., and Marini, F. Physical and functional crosstalk between Fanconi anemia core components and the GINS replication complex. DNA Repair (Amst) doi: 10.1016/j.dnarep.2010.10.006 .

    SITOGRAFIA

    DNA Repair http://ees.elsevier.com/dnarep/

    SBB - Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie, UniMI http://www.sbb.unimi.it/

    Dr. Federica Marini http://www.sbb.unimi.it/espressione_genica.htm



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